Les Coccis Gram Positif : Staphylococcus Aureus


Introduction : 

Les coccis a Gram positive font partie des flores commensales de la peau et des muqueuses 
chez l’homme. De ce fait ils sont fréquement isolés en bactériologie médicale, le probléme 
étant de faire la part ; lorsqu’une culture est positive. Entre une situation pathogène et une contamination de l’échantillon par une bactérie commensale.

De nombreuse espéces sont maintenant bien définies ; elles peuvents être aérobies, anaérobies strictes, anaérobies-aérotolérantes ou bien aérobies-anaérobies facultatives.

Deux familles jouent un roles majeur en pathologie, ce sont les Micrococaccaceae et les streptococcaceae. 


Famille des Micrococcaceae :

La familles des Micrococcaceae est composée de quatre genres : Micrococcus, Stomatococcus, planococcus et staphylococcus. Les espéces retrouvées en pathologie humaine appartiennent presque exclusivement aux genres Micricoccus et  staphylococcus.

Caractères distinctifs entre les 2 principaux genres  :



 genre staphylococcus:

comprend une trentaine d'espèces : certaines sont des hôtes de l'homme, d'autres des animaux, d'autres sont rencontrées à la fois chez l'homme et l'animal.

Chez l'homme, les espèces les plus couramment isolées sont :
  • Staphylococcus aureus, le plus pathogène,
  • Staphylococcus epidermidis, souvent considéré comme un opportuniste,
  • Staphylococcus saprophyticus, responsable d'infections urinaires chez la femme jeune, et à une fréquence moindre, St haemolyticus, St. hominis, St. capitis et St. auricularis.


STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1- Habitat :

Il s’agit de germes très répandus dans la nature (air, eau, sol). Les staphylocoques en particulier les espèces  Staphylococcus aureus  et  Staphylococcus epidermidis, font partie de la flore normale de nombreux individus qui sont des { porteurs asympthomatiques } 

Cependant ces souches peuvent être à l’origine d’auto-infections ou contaminer d’autres individus. Les staphylocoques peuvent être trouvés particulièrement dans les fosses nasales antérieures. Les staphylocoques sont fragiles et vivent à l’état commensal au niveau des téguments ou des muqueuses de l’homme ou des animaux.  Certains groupes sont rencontrés dans le sol, dans  l’air et dans l’eau. Leur présence normale au niveau cutanéomuqueux explique  qu’ils peuvent contaminer fréquemment des prélèvements et constituer des souillures.

  2- Pouvoir pathogéne :

Staphylococcus aureus, comme toute bactérie pyogène, est à l’origine d’infections suppuratives. Il s’agit le plus souvent d’auto-infections à partir de la flore endogène, mais l’origine peut aussi être exogène ; c’est le cas des toxi-infections. Les infections suppuratives impliquent une prolifiration bactérienne, une invasion, une destruction des tissus de l’hôte et une réponse inflammatoire locale et systémique. Elles sont à l’ origine :
  •    De staphylococcies cutanées, sous-cutanées et muqueuses qui peuvent être superficielles (impétigo, onyxis et folliculites) ou profondes ( furoncles, abcès, hidrosadénites et anthrax) ;  
  •  Des septicémies ;
  •  De staphylococcies viscérales à partir de bactériémies, avec des localisations osseuses (ostéomyélites), pleur pulmonaires, urogénitales, neuroméningées ou cardiaques (endocardites).

Les infections nosocomiales à S. aureus ne sont pas exceptionnelles : infections du site opératoire, ostéoarticulaire, neurochirurgicales ou endophtalmiques. Les toxémies staphylococciques sont associées à la production des toxines. 

  3- Caractéres bactériologiques :   

          1- Caractères morphologiques :


Dans le pus  S.aureus se présente sous l’aspect de cocci en petit amas,  en  diplocoques ou en très courtes chaînettes (3 à 5 éléments), mesurant 0,8 à 1µm, positivement colorés au Gram. 

Sur les cultures en milieu solide il se dispose en  { grappe de raisin },  alors qu’en milieu liquide il est isolé en diplocoques. Il est immobile, non sporulé et ne possède pas de capsule visible au microscope optique sauf de très rares souches (souches Smith).

                 2- Physiopathologie :


Le pouvoir pathogène d’une souche est lié à l’expression de facteurs de virulence. Nous aborderons dans ce chapitre uniquement le cas de S. aureus dont les facteurs de virulence sont les mieux caractérisés. On distingue :


  •  les protéines de surface (adhésines) qui permettent la colonisation de l’hôte, 
  • des facteurs qui conduisent au développement et à l’extension de l’infection,
  •  des toxines spécifiques responsables de syndromes toxiniques.

             2.1 Protéines de surface: colonisation :

Pour qu’une bactérie colonise un tissu, il faut au préalable qu’elle y adhère. Cette étape est déterminante dans le développement ultérieur de l’infection. S. aureus colonise la peau et les muqueuses en adhérant aux cellules et aux composants de la matrice extra-cellulaire. La colonisation s’observe en dehors de toute lésion préalable. Elle est cependant favorisée par toute effraction de la barrière cutanéo-muqueuse.

Plus d’une dizaine d’adhésines ont été identifiées, les mieux caractérisées sont : 

  •  La protéine A :
elle se lie au facteur de von Willebrand. Le facteur de von Willebrand est un peptide présent au niveau de l’endothélium lésé. La protéine A peut de ce fait jouer le rôle d’une adhésine au début d’une infection intra-vasculaire. De plus, la protéine A possède deux domaines de liaison aux immunoglobulines : un fixant le fragment Fc (partie constante) et l’autre le fragment Fab (partie variable).
  •  La protéine de liaison au collagène de type I, II et IV :
Cette adhésine joue un rôle très important dans les infections ostéo-articulaires.

  •  La protéine de liaison à la fibronectine :
Cette protéine contribue à l’adhérence de S. aureus aux caillots plasmatiques mais aussi aux biomatériaux ayant un contact prolongé avec le sang. Elle joue un rôle très important dans l’initialisation des infections sur corps étrangers. 
  •  Les protéines de liaison au fibrinogène: Clumping factor (ClfA, ClfB):
Le clumping factor est un récepteur pour le fibrinogène qui provoque l’agrégation des bactéries en présence de plasma. Cette adhésine joue un rôle dans les infections des plaies et les infections sur corps étranger. Il semble que le ClfB soit fortement impliqué dans la colonisation nasale.


     2.2 Facteurs protégeant la bactérie de la phagocytose:

Quatre vingt dix pour cent des souches cliniques de S. aureus produisent une capsule composée d’exopolysaccharides. Les exopolysaccharides ainsi que la protéine A protègent la bactérie de la phagocytose favorisant ainsi l’extension de l’infection.


      2.3 Les toxines :

Le pouvoir pathogène de Staphylococcus aureus tient également à la production d'un grand nombre de substances diffusibles.

  • Hémolysines :
L'hémolysine a ou staphylolysine a est cytotoxique et cytolytique. Elle a un effet nécrotique sur la peau lié à son effet vasoconstricteur. C'est une hémolysine active surtout sur les hématies de lapin.
La staphylolysine a entraîne la production d'anticorps appelés anti-staphylolysines a (ASTA) recherchés dans le sérodiagnostic. Il existe d'autres hémolysines, ß, g et d dont le pouvoir toxique est incertain.
  • Leucocidine :
Cette toxine agit sur les granulocytes, les macrophages et les basophiles et provoque leur immobilisation puis leur dégranulation et leur lyse.
  • Entérotoxines: 
Certaines souches de Staphylococcus aureus élaborent des toxines protéiques responsables de toxi-infections alimentaires : les entérotoxines staphylococciques, au nombre de cinq : A, B, C, D, E. C'est leur activité de superantigène qui explique les effets toxiques.
  • La toxine du syndrome de choc toxique:
Certaines souches de Staphylococcus aureus élaborent une toxine pyrogène et létale : la toxine du syndrome de choc toxique ou TSST (toxic-shock syndrom toxin). Elle se comporte aussi comme un superantigène.
  • Exfoliatines ou épidermolysines :
Certaines souches de Staphylococcus aureus élaborent des toxines protéiques A ou B. Elles sont responsables de staphylococcies cutanées bulleuses dues à des lésions histologiques caractérisées par un décollement intra-épidermique donnant lieu au syndrome de la "peau ébouillantée" ou syndrome de Ritter.

           2.4 Les enzymes non toxiques :
  •  La coagulase-libre :
est une exo-enzyme coagulant le plasma d'homme ou de lapin. C'est une protéine thermostable, toujours produite par les souches de S.aureus (et non produite par S.epidermidis et S.saprophyticus). Elle active la prothrombine en thrombine. La thrombine ainsi activée agit sur le fibrinogène qu'elle tranforme en fibrine.. C'est un facteur primordial dans le pouvoir pathogène en coagulant le plasma autour des coques et en les protégeant de la phagocytose ; elle est à l'origine des thrombophlébites suppurées.
  • La fibrinolysine :
est caractéristique des souches pathogènes humaines. En activant le plasminogène en plasmine, elle provoque la dislocation des caillots endoveineux qui libère des micro-embols septiques, facteurs de septicémie et de localisations septiques secondaires.
  •  Les désoxyribonucléases (ou DNAses) :
sont des facteurs de destruction des noyaux cellulaires. La DNAse thermostable est spécifique de S.aureus.
  •  La hyaluronidase :
est une enzyme thermolabile hydrolysant l'acide hyaluronique, substance fondamentale du tissu conjonctif : elle favorise ainsi la diffusion des staphylocoques dans le tissu conjonctif.
  •  La lipase : 
80 % des souches produisent cette enzyme qui semble constituer un facteur de virulence dans les abcès où, en modifiant les lipides bactériens, elles favorisent la survie des staphylocoques.

             2.5 Antigènes : 

Il existe des antigènes capsulaires, de nature polysaccharidique et des antigènes pariétaux constitués par le peptidoglycane et les acides teichoïques. La plupart de ces antigènes permettent le sérotypage des souches.

 4-Diagnostic bactériologique: 

     1- prélèvement et transport :


Les staphulococques sont suffisamment résistants à la dessications et au refroidissement pour qu’iln’y ait pas de conditions particuliéres de prélèvement et de transport. Les staphylocoques et notamment  S.aureus peuvent se retrouver à partir de n’importe quel prélèvement. Mais les bonnes procédures de prélèvements doivent êtres strictement appliquées, notamment en ce qui concernne l’asepsie.

==>  Citez les prélèvements dans lesquelles S. aureus est pathogène ?  et est commensal ?
  • Pathogène :
  - Tous les prélèvements normalement stériles : sang, LCR, urines, prélèvements d’organes (biopsie), liquides de ponctions (articulaire, pleural, ascite …), LBA …

 - Prélèvements de lésions cutanées (pus …) : S. aureus est un commensal sur la peau saine et les muqueuses mais est responsable de véritables infections cutanées sur peau lésée


  - Prélèvements oculaires

  • Commensal : 
  - Selles (les diarrhées infectieuses à S. aureus sont liées à l’ingestion de toxines)

  - Prélèvements ORL : fosses nasales


 - Peau ou muqueuse non lésée (et éventuellement associé à une flore normale (dans les prélèvements vaginaux par exemple)



   2- Examen direct :


Après coloration de Gram, les staphylocoques apparaissent comme des cocci à Gram positif. Ils peuvent être isolés, en diplocoques ou en amas. Les amas sont les plus caractéristiques du genre staphylocoque.




L’examen direct du prélèvement s’il est possible donne une orientation diagnostique importante. En effet, l’association de cocci Gram positif et de polynucléaires dans un prélèvement évoque fortement une infection à staphylocoque. Cependant, le diagnostic définitif du genre et de l’espèce ne sera obtenu qu’après la culture et l’identification des souches.


   3- Caractères culturaux


Staphylococcus aureus  est un germe aérobi-anaerobie facultatif. Il croit abondamment sur milieu gélosé (colonies de 1 à 2 mm de diamètre) ; certaines souches produisent un pigment jaune orangé, mais cette production est irrégulière, car certaines donnent des colonies blanches ; le caractère pigmentaire n’est pas propre à l’espèce.

La culture est obtenue en 18 à 24 heures à 37° C (culture possible entre 10 et 45°C) sur milieux ordinaires. S.aureus pousse en présence de fortes concentrations salines (milieu sélectif de chapman à 75% de Nacl). Le pH optimal  est de 7,0 à 7,5. Certains facteurs de croissance sont indispensables (vitamine B1,  acide nicotinique)

En bouillon ordinaire, la culture est rapide et les staphylocoques se multiplient en quelques heures, formant un trouble homogène ou un dépôt. Il n’y a pas de production de pigment en milieu liquide.
Sur gélose ordinaire, les colonies sont lisses, rondes, bombées et leur diamètre est de 1mm.

A +4° C, les staphylocoques conservent leur vitalité pendant 3 mois dans le pus, pendant 1 an sur gélose, ils sont détruits à 58° C au bout de 60mn. Leur croissance est inhibée par les androgènes et la progestérone. 

Staphylococcus aureus possède un équipement enzymatique permettant de métaboliser de nombreux substrats (glucides, lipides, protides). 
Il existe des colonies naines de S. aureus provenant de milieux contenant certains sels minéraux (chlorure de lithium ou de baryum), certains colorants (violet de gentiane, acrydine orange), certains antibiotiques (methicilline, aminoside) ou provenant de prélèvements de patients mis sous antibiotiques. Ces souches retrouvent généralement leurs caractères culturaux normaux après une ou deux subcultures.  pour les produit pathologiques polymicrobiens, on a recours à des milieux sélectifs tels que :

  •  le milieux chapman : qui est un milieu gélosé hyper-salé (75% de NACL ) contenant du mannitol ; il permet une culture abondante de S.aureus après une incubation de 24h à 48h

  •  le milieux de Baid-parker : qui est à base de tellurite de potassium et de jaune d’œuf. Sur ce milieux , S aureus se présente sous forme de colonies noires ( reduction de tellurite) , ce milieux est surtout utilisé en bactériologie alimentaire.

    4- Diagnostic de genre et d’espèce :


Catalase:

La catalase est un caractère quasi-constant chez les staphylocoques. La mise en évidence de la catalase permet de distinguer parmi les cocci à Gram positif les staphylocoques et les streptocoques.




Coagulase :

Le test mettant en évidence l’aptitude des bactéries à coaguler le plasma est le principal test caractérisant S. aureus. Le test de détection consiste à incuber pendant 4 heures à 37°C un mélange de plasma de lapin et de la souche à tester. L’apparition d’un caillot est observée en inclinant le tube à 90°C. Le test de la coagulase permet l’identification de 99% 


des souches de S. aureus mais certaines souches ne produisent pas de coagulase. L’identification de l’espèce est dans ce cas réalisée par d’autres tests.

Tests d’agglutination :

Plusieurs tests d’agglutination détectant un ou plusieurs antigènes ou récepteurs de surface (récepteur pour le fibrinogène, protéineA, antigènes capsulaires) sont commercialisés.
En pratique, il est recommandé d’utiliser deux tests pour l’identification de S. aureus : la détection de la coagulase et un test d’agglutination. Toute discordance entre les deux devra conduire à une identification biochimique

Identification biochimique:

La détermination de l’espèce peut être réalisée à l’aide de galeries biochimiques d’identification. Ces systèmes utilisent des tests d’acidification ou d’assimilation des sucres (A) et des tests enzymatiques (B).
Ils sont partiellement ou totalement automatisés. Ces galeries sont utilisées essentiellement pour l’identification des staphylocoques à coagulase négative.



 Légende :  + positif ; ± faible ; - : négatif ; V : variable ; ces signes indiquent une fréquence de 90 à 100p.100 ; entre () ils indiquent une fréquence de 70 à 89 p.100 ; ±C : gradient avec de grosses colonies

Interprétation :
Les staphylocoques et en particulier les staphylocoques à coagulase négative font partie de la flore naturelle de l’organisme. Ainsi, l’interprétation devra toujours tenir compte du site d’isolement de la bactérie, des signes cliniques et cytologiques d’infection (présence de polynucléaires). Il sera généralement nécessaire de répéter les prélèvements ; l’isolement répété de la même souche étant un argument en faveur d’une infection.

5-  Sensibilité aux antibiotiques :

              1- antibiogramme standard:


                    1.1 Principe :



L’antibiogramme a pour but de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’une souche bactérienne vis-à-vis de divers antibiotiques. Le résultat pratique est la classification du microorganisme dans la catégorie sensible (S), intermédiaire (I) ou résistant (R) à chaque antibiotique.



             2.2  Technique: 


Des disques de papier buvard imprégné des antibiotiques à tester sont déposés à la surface du milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à étudier.
Après incubation, les disques s’entourent de zones d’inhibition circulaires correspondant à une absence de culture. Lorsque la technique est parfaitement standardisée, les diamètres des zones d’inhibition dépendent uniquement de la sensibilité du germe. Pour chaque antibiotique, on mesure le diamètre d’inhibition de la croissance bactérienne et on en déduit le profil de sensibilité de la souche étudiée. 

Milieu utilisé :

Gélose Mueller Hinton

Ensemencement:

Nous avons dilué l’inoculum au 1/100ème avant de l’ensemencer par écouvillonnage.

Incubation:

A 37° C

Lecture:

Après 24h d’incubation

         2.3 Résultats :

La zone d’inhibition est mesurée par le diamètre en mm. Si le diamètre mesuré est inférieur au diamètre correspondant à la concentration critique supérieure la souche est Résistante.
Si le diamètre mesuré est supérieur au diamètre correspondant à la concentration critique inférieure, la souche est Sensible. Si le diamètre mesuré est compris entre les diamètres correspondant aux deux concentrations critiques, la souche est de sensibilité intermédiaire.

         2.4  Interprétation des résultats :

Nous avons comparé les profils de sensibilité en plaques avec ceux de l’antibiogramme standard, afin de déterminer l’inoculum qui donne en plaques un profil de sensibilité proche de celui obtenu avec l’antibiogramme standard et ceci dans un intervalle de temps très court. 

B-lactamines :

La résistance de Staphylococcus aureus aux bêtalactamines relève de plusieurs mécanismes:
  • La production, d'origine plasmidique, de bêtalactamases,
  • La modification de la cible, d'origine chromosomique
    aminosides:

    Staphylococcus aureus est normalement sensible aux aminosides mais des résistances sont fréquemment détectées surtout parmi les souches méti-R. Elles sont dues à une inactivation de l'antibiotique par diverses enzymes bactériennes.

    Au- total:

     Actuellement, environ 95% des souches sont résistantes à la pénicilline G, aux aminopénicillines, aux carboxypénicillines et aux uréidopénicillines.
    Les souches communautaires sont, en général, sensibles à la pénicilline M (méticilline, oxacilline) qui reste l’antibiotique de choix. Elles sont le plus souvent sensibles aux macrolides, aminoglycosides, fluoroquinolones et synergistines. Depuis quelques années, nous observons la diffusion de souches communautaires résistant à la méticilline; cependant ces souches restent minoritaires.

    Les glycopeptides, la rifampicine, l’acide fusidique sont, par ordre décroissant, les molécules qui restent le plus souvent actives sur ces souches. Ces souches sont plus communément appelées souches méti-R ou SARM (S. aureus Résistant à la Méticilline).

    A retenir :




    Voici un lien qui vous permet de consulter et télécharger une présentation PowerPoint sur ce sujet, qui peut vous aider dans vos propres travaux :

    https://drive.google.com/file/d/0B3w8pmSxHgC1dGc1TWN6eEJKc0k/view?usp=sharing                                                                                                                    

                                                                                                                         ‪#‎ETL_Blog_Team‬
                                                                                                                                 ‪#Iman_ES


           Documentation :


    - cours de Isabelle Verdier1, Gérard Lina1, Yves Gillet1-2 et François Vandenesch1 : 


    1-Centre National de Référence des Staphylocoques, INSERM E0230, Faculté de Médecine Laennec, Lyon
    2 -Service de Pédiatrie, Hôpital Edouard Herriot, Lyon

    -  Conférence d’internat n°1 : Cocci Gram positif
    - cours de bactériologie : Dr anne Decoster et Dr jean-claude lemahieu 

    - Bactériologie Médicale : françois Denis/ Marie-cécil ploy/ christian Martin/ Edouard Bingen/ Roland Quentin


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