1 - Culture des bactéries :
Pour
cultiver les bactéries, on utilise des milieux qui peuvent être liquides
(bouillons) ou solides.
En
milieux liquide les bactéries se dispersent librement et
leur multiplication se traduit par un trouble, le plus souvent homogène.
Sur un
milieux solide, les bactéries se déposent à la surface.
Lorsque
la quantité de bactéries est faible, chaque bactérie va pouvoir se multiplier
sur place jusqu’à former une colonie : un amas de bactéries visible à l’œil nu. Si la
densité bactérienne est trop élevée dans l’échantillon ensemencé, les colonies
sont confluents et forment une nappe.
Intérêts des milieux solides :
- L’emploi de milieux solides permet le dénombrement des bactéries viables dans un échantillon. Il suffit en effet pour cela d’étaler sur des milieux solides un volume connu de différentes dilutions de l’échantillon et de compter les colonies obtenues "dénombrement des unités formant colonie" avec la dilution adéquate. (Méthode utilisé entre autre en bactériologie alimentaire).
- Les milieux solides permettent également d’apprécier la morphologie des colonies qui peut varier selon les espèces bactériennes.
2 – Cinétique de la croissance bactérienne :
Elle s’étudie
en milieu liquide, soit par turbédimétrie, soit par dénombrement des unités
formant colonie (comme décrit précédemment). Après une phase de latence, les
bactéries se multiplient de manière exponentielle.
Dans des conditions favorables, le temps de doublement de la plupart des bactéries rencontrées en pathologie est de l’ordre de 30 minutes et leur concentration peut atteindre 108 à 109 par mL, puis la croissance s’arrête, c’est la phase stationnaire, suivie d’une baisse progressive du nombre de bactéries viables.
3 – Besoins nutritifs :
- L’eau
- Les ions : principalement K+, Mg++, et phosphates
- L’azote et le soufre : apportés, selon les cas, sous formes minérale ou organique.
- Source de C : certaines bactéries de l’environnement peuvent utiliser le CO2 atmosphérique et à partir de ce dernier et d’éléments minéraux, synthétiser tous leurs composants. Ces bactéries sont dites autotrophes. Les bactéries que l’on rencontre en pathologie sont des bactéries hétérotrophe, c’est-à-dire des bactéries ayant besoin d’un apport de C sous forme organique, en général sous forme de sucre. Toutefois l’addition de CO2 dans l’atmosphère améliore souvent la croissance de ces bactéries.
- Les oligoéléments : le fer en particulier, mais aussi Co++, Mn++, Zn++
- Les facteurs de croissance : certaines bactéries sont capables de réaliser toutes leurs synthèses avec les éléments énumérés ci-dessus. D’autres bactéries, dites auxotrophes, sont incapables de synthétiser certains constituants, comme par exemple un acide aminé ou un coenzyme. Ces constituants doivent alors être présents dans le milieu de culture pour permettre la croissance bactérienne et sont appelés facteurs de croissance.
4 – Pénétration des éléments nutritifs :
Les
petites molécules peuvent traverser la membrane cytoplasmique (et la membrane
externe des bactéries à Gram négatif). La traversée peut se faire passivement
ou à l’aide de système de transport actifs comme les perméases.
L’absorption
du fer est facilitées par sa combinaison préalable à des molécules sécrétées
par la bactérie, les sidérophores.
Les
grosses molécules peuvent être dégradées par des exoenzymes produites par
certaines bactéries.
5 – Conditions Physico-chimiques de la culture :
Température :
La
plupart des bactéries rencontrées en pathologie ont une température optimale de
croissance voisine de 37°C --> bactéries mésophiles, mais pour certaine cette température est de l’ordre
de 30°C. la plupart des bactéries ne se multiplient pas à basse température,
mais certaines (comme Listeria) peuvent continuer à se multiplier à des
températures proches de 0°C. les bactéries non sporulées que l’on rencontre en
pathologie sont tuées à des températures dépassant 60°C. Par contre, certaines
bactéries de l’environnement, dites thermophiles, peuvent se multiplier à des
températures élevées.
PH :
Les pH
optimaux sont proches de la neutralité --> bactéries neutrophiles. La tolérance aux variations de pH est
très variable suivant les bactéries.
Pression
osmotique :
Grâce à
leur paroi, les bactéries sont relativement tolérantes aux variations de
pression osmotique. Toutefois des concentrations élevées de NaCl ou de sucre
inhibent la croissance bactérienne. Ces procédés sont utilisés pour la
conservation de certains aliments. Certaines bactéries, dites halophiles,
adaptées au milieu marin, ne cultive pas en l’absence d’une concentration minimale de NaCl.
Oxygène :
Les
bactéries se divisent en plusieurs catégories selon leur relation avec
l’oxygène atmosphérique :
- Les bactéries aérobies strictes : ne cultivent qu’en présence d’oxygène
- Les anaérobies strictes : ne cultivent qu’en l’absence d’oxygène (ce qui nécessite des conditions de culture spécifiques)
- Les aérobies-anaérobies facultatives : cultivent en présence ou en l’absence d’oxygène. Ce sont les plus fréquentes en pathologie.
- Une dernière catégorie est constituée par les bactéries microaérophiles qui ne cultivent que sous une faible pression d’oxygène.
6 – Métabolisme énergétique :
Très
schématiquement on peut opposer les bactéries ayant un métabolisme fermentatif
et celles ayant un métabolisme de type respiratoire.
Chez les
premières la dégradation du glucose est incomplète et aboutit à la formation de
divers composés organiques (en particulier d’acides organiques). Chez les
secondes le processus respiratoire permet la dégradation du glucose dans le
cycle de Krebs.
L’accepteur final d’électrons est alors l’oxygène. Chez les
bactéries le système de transport d’électrons est situé dans la membrane
cytoplasmique.
7 - Milieux de culture en bactériologie médicale :
On
utilise des milieux liquides et des milieux solides.
Les milieux
liquides ont l’avantage de pouvoir être ensemencés avec un échantillon plus
important et de faciliter la croissance des bactéries fragiles. Ils ne sont
utilisés que pour des prélèvements provenant de sites normalement stériles
(sang, liquide de ponction). Le résultat de la culture est généralement
non interprétable en cas de contamination. Pour les hémocultures il existe des
automates permettant de détecter une croissance bactérienne par la production
de CO2 (méthode plus sensible que l’appréciation de la turbidité).
Sur les
milieux solides l’échantillon est déposé en un point est étalé par une série de
stries successives à l’aide de la pointe d’une pipette pasteur ; manœuvre dite
d’isolement.
Après
incubation, la culture sur milieu solide permet d’apprécier :
- Le nombre de colonies (donc la richesse bactérienne de l’échantillon)
- L’aspect des colonies (qui peut orienter le diagnostic)
- Le caractère uniforme ou non des diverses colonies (ce qui permet de savoir si l’échantillon contient une ou plusieurs espèces bactériennes)
Les
milieux utilisés en routine sont des milieux complexes dont certains sont
additionnés de sang et incubés entre 35°C et 37°C, sous diverses atmosphères
(air, air+CO2, anaérobiose). Ces milieux permettent la croissance en 24 heures
de la plupart des bactéries rencontrés en pathologie.
Toutefois
il n’existe pas de condition de culture convenant à toutes les bactéries.
Certaines nécessitent une culture prolongées (plusieurs jours, voire plusieurs
semaines), une atmosphère à faible pression d’oxygène (bactéries
microaérophiles), une température d’incubation de 30°C.
Certaines
bactéries ne peuvent être cultivées que sur des milieux spécifiques
(mycobactéries, Legionella, Mycoplasma). D’autres ne peuvent être cultivés que
sur des cellules (Chlamydia, Rickettsia).
Enfin il
est impossible de cultiver les agents de la syphilis et de la lèpre.
Lorsqu’un
prélèvement provient d’une région ou la flore commensale est abondante (selle,
voie respiratoire) on peut avoir intérêt à utiliser des milieux dits sélectifs.
Ces milieux contiennent des additifs (colorants, antibiotiques, NaCl) destinés
à inhiber des bactéries autres que celles recherchées.
Voici un lien qui vous permet de consulter et télécharger une présentation PowerPoint sur ce sujet, qui peut vous aider dans vos propres travaux :
https://drive.google.com/file/d/0B3w8pmSxHgC1eFd6aU55alNUWG8/view?usp=sharing
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Documentation :
- Bactériologie médicale ; C. Nauciel et J-L. Vildé 2éme édition